Win Tech - 신약개발 효율성을 높이기 위한 나노바이오 전자센서 개발
Win Tech는 공공연구기관의 연구성과 확산을 위해 국가과학기술연구회(NST)와 공동으로 우수 공공기술을 선별하여 게재하고 있습니다.
▲ 권오석 선임연구원
한국생명공학연구원 위해요소감지
BNT연구단
한 개의 신약이 시장에 나오기까지는 10년 이상의 연구개발 기간과 막대한 투자가 필요하지만 실질적인 성공확률은 매우 낮은 1/5,000~1/10,000에 불과하다.
따라서 불필요한 투자를 막기 위해서는 타깃으로 하는 질환에 화학물질이 약효가 있는지 확인하는 작업인 약물 스크리닝이 선행되어야 한다.
기존에 사용되는 약물 스크리닝 기법으로는 In vitro enzymatic assay, cell based assay 및 동물실험이 있으며 관련 연구가 지속적으로 진행되고 있다.
현재 신약 후보물질 스크리닝 기법은 대부분 세포 기반에서 진행되며 세포를 배양하는 과정이 선행되어야 한다.
이때 배양되는 환경이 적절하지 않다면 스크리닝용으로 적합하지 않은 세포가 배양된다.
따라서 다양한 환경 변수를 제어해야 하므로 많은 비용이 들고 시간이 오래 걸리며 고도의 실험기술을 필요로 한다.
이러한 세포 기반의 스크리닝이 가지고 있는 시간·경제적 한계를 극복하기 위해 다양한 연구가 수행되기 시작하였고, 본 연구팀은 나노 바이오 융복합 기술을 통해 기존의 세포 기반 신약 스크리닝 분석기법을 대체할 새로운 고감도 나노바이오 전자센서를 제작하였다.
바이오센서란 특정 분자를 감지할 수 있는 생물학적 탐침(Bioprobe)이 전기 또는 물리화학적 방법을 이용한 신호변환기(Transducer)와 결합되어 타깃 물질과의 상호작용을 인식하는 과정을 거쳐 극미량의 타깃 물질을 매우 선택적으로 인식하게 하는 소자를 말한다.
대표적인 생물학적 탐침으로는 압타머(Aptamer), 항원/항체 혹은 단백질(Antigen or Peptide), 수용체(Receptor) 등이 있으며, 주로 사용하는 변환기로는 전도성 나노구조체(전도성 고분자 나노입자 및 튜브, 나노와이어, 그래핀 등) 및 형광 구조체(퀀텀닷(Quantum dot), 에너지 상향물질 나노물질(Upconversion) 등)들이 활용되고 있다.
특히, 나노입자, 나노패턴 등과 같은 나노기술을 이용하여 바이오센서의 성능을 월등하게 개선하거나, 분자수준에서 물질을 검출할 수 있는 센서를 나노바이오 센서라고 지칭한다.
이들 구성요소들로 이루어진 나노바이오 센서들의 감지 방법은 측정하는 신호와 종류 및 방법에 따라서 다양하게 구분할 수 있다.
형광공명에너지전이(FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer), 무표지식 포토닉 크리스탈(Photonic crystal) 그리고 표면증강라만분광법(SERS, Surface-Enhanced Raman Spectroscopy) 방식은 광에너지 전이/변환 방식을 주로 활용한 분석방법이다.
광학을 이용한 나노바이오 센서는 국부적인 굴절율의 변화나 표면플라즈마 공명(SPR, Surface Plasmon Resonance)을 이용하여 반응과 검출을 한다.
또한 캔틸레버의 미세진동이나 나노공진자의 탄성파를 활용한 센서도 있으며 이들은 나노구조체의 기계적 특성을 이용한 나노바이오 센서이다.
나노선 채널에 의한 전류변화, 전위차 측정 등을 이용하는 다양한 종류의 전류 변환 감지센서도 개발되었다.
이 글에서는 전기변환 방식의 나노바이오 센서인 나노재료와 반도체 소자 간의 집적형태로 이루어진 전계유발 효과 트랜지스터(FET, Field-Effect Transistor) 기반 나노바이오 센서 개발 및 응용연구에 대해서 소개하고자 한다.
일반적으로 소스(S, Source), 드레인(D, Drain), 그리고 게이트(G, Gate)로 이루어진 FET 구동방식은 게이트 전극에 전압을 걸어 채널의 전기장에 의하여 전자 또는 양공이 흐르는 관문(게이트)이 생기게 하는 원리로 소스, 드레인의 전류를 제어하는 트랜지스터이다.
전류의 이동 통로가 정공에 의해서 진행되는 형태를 p형, 전자에 의한 운반형태를 n형이라고 일컫는다.
수용체가 결합된 p형 FET의 경우, 수용체와 표적물질 간의 결합으로 유도된 채널표면 전위 변화에 의하여 발생한 전하 밀도 변화로 전류가 변화하게 되어 실시간 모니터링이 가능하다(그림 2).
본 연구에서 사용한 도파민 수용체는 상용화된 약물 중 50% 이상의 타깃이 되고 있는 G단백질 연결 수용체에 속해 있는 단백질로 인간의 중추신경계의 신경전달과 관련이 있는 매우 대표적인 단백질이다.
이는 세포막에 발현되어 있는 막 단백질로 그 구조가 매우 복잡하고 소수성이 매우 강해 이종세포 특히 대장균을 이용한 생산이 극히 어려운 것으로 알려져 있다.
이러한 한계를 극복하기 위해 유전자 재조합 기술을 이용하여 인간 도파민 수용체 유전자를 클로닝 하였고 단백질 배양, 발현용 플라스미드 등의 최적화를 통하여 대장균 시스템을 이용한 대량 발현에 성공하였으며, 이를 분리·정제하고 재접힘을 유도하는 구조형성 최적화를 통해 단백질의 올바른 구조를 형성하였다.
우선, 도파민 수용체 유전자를 PCR을 통하여 증폭 후 발현 벡터에 삽입한 후, 도파민 수용체를 포함하는 발현 벡터로 대장균을 형질 전환한 후, 항생제를 포함한 선별배지로 형질전환된 대장균만을 선별한다.
그 후, 대장균 배양 과정에서 IPTG(Isopropyl β-D-thiogalactoside)를 처리하여 수용체의 발현을 유도(Induction)한다.
수용체 발현이 유도된 대장균 세포를 수확하여 초음파 분쇄(Sonication)한 후 도파민 수용체를 포함하는 불용성 부분(Insoluble fraction)을 수확한다.
일반적으로, 정제된 도파민 수용체는 접힘이 이루어지지 않은 형태여서, 본래의 형태로 재구성할 필요가 있다.
따라서, 적절한 계면활성제 조건을 갖추어 수용체를 용액 내에서 본래의 구조로 유지할 수 있게 한다.
비이온성 계면활성제인 Cymal 6와 DDM(n-dodecyl-β-Dmaltopyranoside)을 사용하여 계면활성제 미셀을 만들면 생체 모방 막 환경을 조성하여 액체 내에서 안정한 수용체를 얻을 수 있다.
재구성 된 단백질의 정확한 접힘을 알아보기 위해, 원편광 이색성(CD) 분광법으로 재구성 된 수용체를 측정한다.
원편광 이색성 분광법 측정을 통해 타원율을 계산하여 재구성 된 수용체가 이차구조를 회복하는지 확인한다.
정제된 수용체는 가용화 및 친화성 크로마토그래피 수지를 활용한 정제, 그리고 재접힘 과정을 거쳐 단백질 기반 나노바이오 센서에 활용하였다.
본 연구에서는 앞서 설명한 고순도 도파민 수용체 단백질을 전도성 나노 튜브 표면에 도입하였다.
전도성 나노 튜브는 약 5㎚의 카르복실화 된 폴리피롤(CPPy) 초박막층이 탄소 나노튜브(CNT)에 코팅된 것으로 도파민의 물리적 흡착으로 인해 발생할 수 있는 신호 잡음을 차단한다.
또한, 나노튜브 표면에 있는 카르복실기는 단백질 수용체의 아민기와 공유 결합하여 고정함으로써 액상에서의 안정성을 제공하며 나노바이오 융합 기술로 인하여 민감도와 표적 물질에 대한 선택성이 매우 뛰어난 검출기를 제조할 수 있다.
특히 도파민 수용체는 도파민 작용물질 및 대항 물질에 대한 강한 선택적 반응으로 인한 특성까지 모두 분석할 수 있다는 점에서 큰 의의를 가진다(그림 3).
더 나아가 다채널 시스템 도입 시, 여러 가지 수용체를 각 채널마다 독립적으로 도입하여 혼합물 속에서의 선택적 감지를 구별해낼 수 있다.
그림 4는 패터닝 된 단일층 그래핀을 활용하여 다채널 나노바이오 센서를 구현한 모식도이다.
상기의 전자 소자에 단일층 그래핀을 올린 뒤, 반도체공정을 통하여 표면 처리를 통해 타깃 물질인 특정 물질들과 특이적 상호작용을 할 수 있는 생물학적 탐침(수용체)을 고정화할 수 있도록 제작하였다.
나노바이오 센서 장치는 소형화, 대량생산, 실시간 관찰, 단일세포, 단분자 분석, 및 공정과정이 저렴하다는 장점을 가지고 있어 활발히 연구되어 왔다.
본 기술을 바탕으로 생산 가능한 다양한 단백질들은 지금까지 식품의 신선도를 예측할 수 없었던 것을, 가능하게 할 것으로 사료된다.
또한, 나노바이오 센서의 융합기술로 전례 없는 새로운 산업화 형성이 가능하다.
식품 산업에서는 식품의 위해물질 검출용 시스템으로 식품의 안정성 분석에 응용될 수 있으며, 융합기술을 이용하여 지능형 약물전달 및 신약 개발 시스템이 개발되어 효율성 증대뿐만 아니라 암 및 특이질환에서 발견되는 특정 바이오물질을 검지하거나, 병을 진단하는 개인 맞춤형 진단 기술 등 다양하게 활용될 수 있다.
질병진단의 경우, 환자의 날숨으로부터 나오는 휘발성 유기화합물의 종류 및 양에 따라 질병을 조기 진단할 수 있으며, 특히 개인 헬스케어 제품으로 IoT 기반의 휴대용 진단기기에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
뿐만 아니라, 분석법의 어레이화를 통한 다중 감지 기술 등 미래 인간의 삶에 있어 최첨단 웰빙 과학기술에 응용할 수 있을 것으로 기대된다.
Win Tech는 공공연구기관의 연구성과 확산을 위해 국가과학기술연구회(NST)가 선정한 “2018년 국가연구개발 우수성과 100선” 기술을 선별하여 게재하고 있습니다.