Win Tech - 히알루론산 하이드로젤 미립구 제조 방법 및 스페로이드 형성 방법
Win Tech는 공공연구기관의 연구성과 확산을 위해 국가과학기술연구회(NST)와 공동으로 우수 공공기술을 선별하여 게재하고 있습니다.
▲ 강선웅 선임연구원
안전성평가연구소 예측모델연구센터
사람의 몸은 정교하고 복잡한 생물학적 시스템으로 이루어져 있다.
특정한 기능을 갖는 세포들의 다양한 조합과 패턴으로 군집을 이루어 조직을 형성하고, 조직들이 다른 종류의 조직과 만나 장기를 만들며, 장기들이 유기적으로 연결되어 생명을 유지하는 시스템이다.
이러한 복잡한 사람의 몸을 모사하기 위해 과학자들이 가장 흔히 쓰는 접근방법 중 하나는 폴리스티렌(Polystyrene) 같은 경화성 플라스틱으로 만들어진 배양접시나 플라스크 안에 세포를 배양하고 다양한 외부자극에 대한 이들의 반응을 관찰함으로써 몸에서 일어나는 현상을 유추하는 것이다.
하지만 사람의 장기는 2차원적 배양접시에 조성된 세포의 군집만으로는 절대 모사될 수 없는 복잡한 구조와 환경을 지니고 있다.
이러한 문제점은 지난 수십 년간 생물공학의 다양한 분야에서 중대한 기술적 걸림돌이 되었으며, 역으로 지난 수십 년간 진행되어 온 새로운 세포 배양기술 개발에 큰 원동력으로 작용하였다.
최근 수년간 다양한 생명공학 분야에서 자주 거론되고 있는 3차원 세포 배양 모델은 이러한 연구의 가장 대표적인 성과로 꼽히고 있다.
3차원 배양은 인체 내 세포들을 둘러싸고 있는 3차원 조직의 구조적, 물리적 성질을 좀 더 정확히 모방할 수 있게 해준다는 큰 장점을 제공한다.
3차원 배양법은 세포의 분화(Differentiation)를 일으키고 그 결과로 발현되는 생리학적 구조와 기능을 장시간 유지하는 데 있어서 기존의 2차원적 방법보다 훨씬 효과적인 것으로 보고되고 있다.
뿐만 아니라 이러한 3차원 세포 배양 방법은 재생 의료나 하이브리드(Hybrid) 인공장기, 생체 유용물질 생산, 생물 조직이나 기관 장기의 기능 조사·탐색, 신약 스크리닝(Screening), 내분비 교란 물질 등의 영향을 평가하는 동물실험 대체법, 센서(Sensor)기능을 가지는 세포 칩 등 각 분야의 산업에 이용이 기대된다.
최근에는 생체 내와 동등한 기능을 갖는 3차원 세포 조직인 스페로이드(Spheroid)의 배양이 주목을 받고 있다.
암을 모사하기 위한 세포 응집(Cell Aggregation)을 유도하기도 하고, 당뇨 치료를 위한 인슐린의 정상 분비를 유도하기 위해서 췌도 세포를 이식함에 있어 응집된 세포를 이식하는 방법 등이 쓰이고 있어 스페로이드의 대량생산이 요구되고 있다.
또한, 줄기세포 연구가 성숙됨에 따라 배아 줄기세포를 3차원 배양하여 각종 분화 기전의 연구에 응용하기 위한 여러 가지 방법이 시도되고 있다.
종래의 3차원 세포 배양 방법으로는 현적 배양법(Hanging-drop Method), 회전식 배양법, 원심분리법, 마이크로 몰딩(Micromolding)법 등이 있다.
예를 들어 바닥면이 깔때기 형상인 웰에 복수의 단일세포를 씨딩하고, 바닥면에서 이 단일세포를 응집 및 분열시켜서 스페로이드를 배양하는 방법, 또는 내부에 중공형관을 포함한 복수의 세포 수용부를 포함하는 3차원 세포 배양 용구를 이용한 배양 방법 등이 개시되고 있다.
하지만 이 접근방법도 극복하기 어려운 기술적 한계를 지닌 것으로 알려져 있다.
이러한 기존 3차원 세포 배양 방법은 별도의 배양 용구를 필요로 하며, 배양 방법이 복잡할 뿐만 아니라 소요 시간도 긴 문제점이 있다.
또한 조직 내에 혈관이 없어 영양과 산소공급이 원활하지 않아 스페로이드 내부의 세포는 생존할 수가 없다.
따라서 3차원 스페로이드를 손쉽게 만들 수 있고, 내부에 세포 사멸 없이 장기간 배양할 수 있는 기술이 3차원 스페로이드 배양법의 핵심 기술이다.
이 글은 바로 이러한 3차원 스페로이드 내부에도 세포가 살아 있어 생존율을 장기간 유지할 수 있는 3차원 세포 조직인 스페로이드 형성 방법에 대하여 소개하고자 한다.
체내에서 조직들은 조직 내에 미세혈관으로부터 끊임없는 영양과 산소를 공급받는다. 세포는 미세혈관에서 150㎛ 이상 떨어져 있으면 생존할 수가 없다.
따라서 이러한 혈관 생성은 성공적인 3차원 배양에 있어 중요하게 고려해야 할 부분이다.
체외에서 조직을 재생시켜 이식하면 혈관이 조직 내로 자라들어 올 때까지 3차원 조직은 주위에서 확산에 의해 영양과 산소를 공급받게 된다.
이때 혈관 형성을 위해 성장인자를 사용하거나 내피세포와 중배엽 줄기세포를 같이 배양하여 혈관 형성을 촉진하기도 한다.
하지만 3차원 조직 내부에는 충분한 영양과 산소를 공급받지 못해 혈관이 형성되기 전에 괴사하는 현상이 발생하는 문제점이 있다.
따라서 3차원 조직 형성 즉시 영양과 산소가 공급될 수 있는 시스템의 개발이 필요하다.
천연 고분자를 이용한 스케폴드는 스케폴드 내부로 영양과 산소를 전달시킬 수 있어 체내 이식시에 유용하게 활용된다.
우수한 생체적합성을 가지는 천연 히알루론산은 종간 특이성, 조직이나 장기 특이성을 갖지 않으며 피부의 보습력 증진, 피부 탄력 유지 및 피부 손상시에 피부 하층부의 손상을 줄여주고 피부의 주요 구성 성분인 콜라겐이 세포 사이로의 움직임을 원활하게 하도록 윤활유와 같은 역할로 스케폴드 제조에 많이 사용되는 물질 중 하나이다.
그러나 천연 히알루론산을 본연 그대로 사용하게 되면 기계적 물성이 좋지 않을 뿐만 아니라 체내에 존재하는 히알루로니다아제라는 효소에 의해 쉽게 분해되어 제거되기 때문에 응용에 있어 제한이 따르게 된다.
이와 같이 천연 히알루론산의 단점을 보완하기 위하여 화학적 수식이나 다양한 가교제를 사용하여 하이드로젤을 형성하는 연구들이 많이 이루어지고 있다.
히알루론산의 화학적 수식과 가교를 통한 하이드로젤 형성은 일반적으로 히알루론산 주쇄에 존재하는 알코올 그룹과 카르복시산 그룹을 통하여 이루어진다.
히알루론산 주쇄의 카르복시산 그룹은 에스테르화(Esterification)에 의한 화학적 수식이 주를 이루며, 하이드로젤 형성을 위한 가교반응은 디히드라지드, 디알데히드, 또는 디술파이드를 이용한 연구가 진행되었다.
또한 카르복시산 그룹에 메타크릴아미드를 도입하여 광가교를 통한 하이드로젤을 제조하는 연구도 진행되었다.
한편으로 히알루론산 주쇄의 알코올 그룹은 디비닐술폰 또는 디글리시딜 에테르를 이용한 연구가 진행되었다.
3차원 조직의 생존율을 향상시키고, 이식 후에도 조직 내 생착률을 높이기 위해 필요한 영양과 산소를 생체적합 고분자의 확산 능력을 이용해 3차원 스페로이드 내부로 전달하고자 하였다.
이를 위해 히알루론산의 알코올기와 폴리(카프로락톤)-b-하이퍼브랜치 폴리클리세폴의 알코올기가 에폭사이드 가교제에 의한 에테르 결합으로 화학적으로 가교된 히알루론산 하이드로젤 미립구를 제조하였고, 제조된 미립구는 3D 스페로이드 형성시 세포와 함께 혼합하여 히알루론산 미립구가 3D 스페로이드 내·외부에 존재하도록 하여 확산에 의해 영양과 산소가 스페로이드 형성 즉시 내부까지 전달되도록 하여 생존율을 유지할 수 있게 하였다.
화학적으로 가교된 히알루론산 미립구를 제조하기 위해 계면활성제가 용해된 오일상 및 염기성 수용액에 히알루론산, 폴리(카프로락톤)-b-하이퍼브랜치 폴리글리세롤과 에폭사이드 가교제가 용해된 수상을 혼합함으로써 W/O 에멀전(Water-in-Oil Emulsion)을 형성시켜 가교반응을 진행하여 히알루론산 하이드로젤 미립구를 제조하였다.
또한 히알루론산 하이드로젤 미립구를 배양배지로 팽윤하고, 팽윤된 미립구와 세포를 혼합하여 스페로이드를 형성하였다.
히알루론산 하이드로젤 미립구를 혈청이 함유된 세포 배양배지에 넣어 팽윤시키고, 배양한 연골 세포를 트립신 효소 처리하여 단일 세포로 부유시켰다.
부유된 연골 세포를 계수하고 팽윤된 히알루론산 하이드로젤 미립구를 세포와 함께 혼합하였다.
세포와 미립구가 들어있는 배지를 현적배양 전용 플레이트에 분주하여 세포 배양 인큐베이터에서 배양하고 하루 뒤 스페로이드가 형성되는지 확인하였다.
각 세포 스페로이드를 1주일, 2주일, 3주일 배양한 후, 4% 파라포름알데하이드에 고정하고 파라핀 블록을 만들어 H&E 염색을 통해 조직의 형태를 관찰하였다.
그 결과 연골 세포로만 이루어진 스페로이드는 3주에서 스페로이드 내부가 대부분 죽은 세포로 이루어져 있었으나, 히알루론산 미립구가 포함된 스페로이드에서는 내부에 있는 세포도 거의 죽지 않은 상태로 존재했고 실제 연골 조직과 유사한 연골 세포방이 형성되고 있음을 관찰할 수 있었다.
또한 면역 결핍 누드마우스에 연골 세포로만 이루어진 스페로이드와 히알루론산 미립구가 포함된 스페로이드를 피하에 이식한 후 4주간에 걸쳐 세포의 생존율을 확인한 결과 히알루론산 미립구가 포함된 스페로이드의 생존율이 현저히 높게 유지되는 것을 알 수 있었다.
또한 4주차 누드마우스 피하에 만들어진 조직을 분리하여 파라핀 블록을 제작하고 H&E염색 및 알시안 블루(Alcian Blue) 염색을 통해 연골 조직 형성능을 확인한 결과 연골 세포로만 이루어진 스페로이드 그룹에 비해 히알루론산 미립구가 포함된 스페로이드에서 조직이 더 견고하고 조밀하게 이루어졌고, 성숙한 연골 조직이 형성되었음을 확인하였다.
히알루론산 하이드로젤 미립구는 빠른 수팽윤 거동에 의해 다공성 공극 구조를 가지므로 이를 이용하여 스페로이드 형성시 유동적으로 용액을 순환시킬 수 있고, 스페로이드 내부까지 산소 및 영양분을 전달하여 세포 생존율을 향상시키고 장기간에 걸쳐 생존율을 유지할 수 있었다.